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      脂質體2000

      • 簡單描述
      • 品牌:Invitrogen 名稱:脂質體2000 轉染試劑 貨號:11668-027 0.75ML和11668-019 1.5ML 韻涵強勢代購,常備現貨,原裝正品,*,月銷量達200管,選擇的理由是:DNA-陽離子脂質體試劑的復合體可以直接加入到細胞培養基中,有血清也不怕。
      • 更新時間:  2022-02-25
      • 產品型號:  
      詳細介紹
      品牌Invitrogen貨號11668-027
      規格0.75ML供貨周期現貨
      主要用途科研應用領域醫療衛生,生物產業

      脂質體2000操作步驟/說明書

      Invitrogen是最為人熟知的轉染產品之一。已知可為517種細胞提供高轉染效率(表達轉基因細胞的百分數)和活性(細胞抽提物中轉入基因的酶產物活性)。

      特點 兩個關鍵性特點使得Lipofectamine 2000試劑的轉染步驟快速簡便:

      (1)DNA-陽離子脂質體試劑的復合體可以直接加入到細胞培養基中,有血清也不怕

      (2)轉染后不需要除去Lipofectamine 2000試劑,無需換培養基

      脂質體2000操作流程 

      事實上Lipofectamine系列產品操作流程都是又快又簡單:稀釋DNA以及Lipofectamine 2000,混合2種稀釋液保溫20分鐘,加入培養細胞中孵育24-96小時檢測結果。下面是Invitrogen提供的詳細流程和注意事項。

      1.轉染前一天,胰酶消化細胞并計數,細胞鋪板,使其在轉染日密度為90%。細胞鋪板在0.5ml含血清,不含抗生素的正常生長的培養基中。

      2.對于每孔細胞,使用50μl無血清培養基(如OPTI-MEMⅠ培養基)稀釋0.8μg-1.0μg DNA。

      3.對于每孔細胞,使用50μl OPTI-MEMⅠ培養基稀釋1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000試劑。Lipofectamine 2000稀釋后4.保溫5分鐘(在30分鐘內同稀釋的DNA混合。保溫時間過長會降低活性。) 注意:即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀釋,細胞也可以使用D-MEM培養。如果D-MEM做為Lipofectamine 2000的稀釋液,必須在5分鐘內同稀釋的DNA混合。

      5.混合稀釋的DNA(第2步)和稀釋的Lipofectamine 2000(第3步)。在室溫保溫20分鐘。

      注意:溶液可能會混濁,但不會影響轉染。復合物可以在室溫保持6小時穩定。

      6.直接將復合物加入到每孔中,搖動培養板,輕輕混勻。

      注意:如果在無血清條件下轉染,使用含血清的正常生長培養基進行細胞鋪板。在加入復合物前移去生長培養基,替換為0.5ml無血清培養基。

      7.在37℃,5%的CO2中保溫24-48小時,無須去掉復合物或更換培養基或者在4-5小時后更換生長培養基也不會降低轉染活性。

      8.在細胞中加入復合物24-72小時后,分析細胞抽提物或進行原位細胞染色,檢測報告基因活性。這依賴于細胞類型和啟動子活性。對穩定表達,在開始轉染一天后將細胞傳代至新鮮培養基中,兩天后加入篩選抗生素。進行穩定表達需要數天或數周。

      9.對于96孔板培養,不再需要提前一天進行細胞鋪板,而可以直接在平板中制備復合物,然后將細胞懸浮液加入到復合物就可以了,這樣進一步減少了轉染時間。這種改進步驟已經過293-H,293-F,COS-7L和CHO細胞的試驗,同傳統方法相比活性稍低??旖莸牟襟E和蛋白表達細胞系的高效轉染使得Lipofectamine 2000非常適用于96孔板的高通量轉染,比如cDNA文庫的篩選和蛋白瞬時表達。

      10.適用細胞株范圍 不同的轉染試劑所適用的細胞株范圍各不相同。一個實驗室常常會用到不止一種細胞株,甚至是比較特殊的細胞株。一個轉染試劑所適用的細胞株越多,當然越受用戶的歡迎。根據Invotrogen的資料,Lipofectamine 2000已經證實可用于高達517種細胞株,覆蓋了相當廣的范圍。

      11.適用的核酸類型和DNA大小有的轉染試劑是為siRNA轉染而設計的,有的則是為DNA轉染設計。Lipofectamine 2000可以適用于包括DNA,siRNA, dsRNA, 熒光標記的Oligo, RNA等在內的核酸轉染,這使得Lipofectamine 2000適用范圍非常廣泛,無論是基因表達分析的DNA轉染,或者是RNAi,Lipofectamine 2000都能勝任,這樣你就不需要為不同目的購買不同試劑了。值得注意的是,zui常用的DNA轉染中有一個DNA大小的問題,太大的質粒不那么好轉。我們暫時還沒有找到Lipofectamine 2000相應的資料。

      12.用量和價格 好東西往往不便宜??墒窃趯嶒炇抑?,價格往往是有殺傷力的。Lipofectamine 2000用的劑量大嗎?價格如何?根據說明書,24孔板轉染每次用2ul左右,1.5ml Lipofectamine 2000大約可做750次24孔板轉染,或者大約150次6孔板轉染,而1.5ml Lipofectamine 2000當前市場價格4667元,0.75ml價格是2798元(可以磨到多少折扣就要看你的侃價功力了)。平均下來,再算上折扣,Lipofectamine 2000性價比還是挺高的。

      13.注意事項 Lipofectamine 2000要求細胞鋪板密度較高,以90%-95%為佳,這有助于減少陽離子脂質體細胞毒性造成的影響。Lipofectamine 2000可用于有血清培養基的轉染,并且轉染前后不需要換培養基,使得操作方便了許多,但是要注意制備轉染復合物時要求用無血清培養基稀釋DNA和轉染試劑,因為血清會影響復合物的形成。復合物形成后是可以加入血清。這里要特別注意檢測所用的無血清培養基是否能和Lipofectamine 2000匹配,比如已知CD293, SFM II, VP-SFM就不行。此外還應該留意,如果你研究的基因要求比較長的表達時間,比如細胞周期相關基因,或者時細胞表面蛋白,選擇細胞鋪板密較低的轉染試劑,不適合用 Lipofectamine 2000。

      14.對于大多數陽離子脂質體試劑,應優化DNA濃度和陽離子脂質體試劑量以得到zui大的轉染效率。DNA和轉染試劑的比例,通常推薦是1:2或者1:3,優化可以從0.5-5之間慢慢試。

      15.使用小劑量確定的優化條件可以用于進行大劑量的轉染,只要根據培養板表面比例線性增加鋪板細胞的數目、陽離子脂質體試劑和DNA量就可以了。

      16.還有轉染的時候培養基中不能添加抗生素??股?,比如青霉素和鏈霉素,一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性,使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導致轉染效率低。所以,在轉染培養基中不能使用抗生素,甚至在準備轉染前進行細胞鋪板時也要避免使用抗生素。這樣,在轉染前就不必潤洗細胞。對于穩定轉染,不要在選擇性培養基中使用青霉素和鏈霉素,因為這些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外,為了保證無血清培養基中細胞的健康生長,使用比含血清培養基更少的抗生素量。

      17.陽離子脂質體應該在4度保存,要注意避免多次反復長時間開蓋,因為可能會導致脂質體氧化而影響轉染效率。當然還有要注意質粒的質量,質粒的內毒素是轉染的大敵,Invitrogen自然是大力推薦自家的質粒純化產品啦,這個嘛,看看生物通前面的質粒純化專題有特別介紹就好啦。

       

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